dpph自由基清除实验(dpph自由基清除原理)

DPPH自由基清除实验是一种常用的抗氧化能力测定 *** 。该实验通过加入不同浓度的抗氧化剂样品与DPPH自由基反应，测定这些样品与DPPH自由基反应后使其褪色的程度，反映出样品的抗氧化能力。实验中，DPPH自由基是一种暗紫色分子，具有单个未配对的电子，通过受 *** 后会失去单个电子而变成稳定的淡黄色分子。因此，抗氧化剂样品加入后会捕获自由基电子，反应后使其褪色程度越明显表明其抗氧化能力越强。

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文丨鲁滨逊的日记

编辑丨鲁滨逊的日记

以30 mL/min向HSCCC中泵满固定相（乙酸乙酯、水溶剂体系作为初始梯度，下相 作为固定相，上相为流动相A，正丁醇、水溶剂体系上相作为流动相B），设定“FWD-OUT” 运行方式和800 rpm的转速运行HSCCC，温度25℃，5 mL/min的流速泵入初始流动相达 到平衡后，计算固定相保留率为71.5%。

对梯度条件与进样量不断调整优化，并进行实验验证，实验调整优化过程如图3-2 （A-E）所示（红色曲线代表溶剂梯度），梯度条件与进样量优化测试依次如下：

如图A所示，化合物4、5分离效果较好，3为主要成分的化合物在清扫模式下一起分 离，6 h内化合物全部洗脱。对梯度条件调整优化，如图B所示，降低150min前洗脱能力， 化合物4、5和7实现较好的分离效果。如图C所示，优化后梯度条件3，化合物4、5和 7完全分离，化合物1、4和6共同分离，3为主要成分的化合物在清扫模式下洗脱。增加 进样量可以制备得到更多的目标化合物，优化的梯度条件3下测试了进样量700 mg，如图 D所示，增大进样量至700 mg，分离过程中固定相流失加重，且各目标组分分离效果不好。 溶剂梯度条件3下，进样量调整为500 mg(图E)，实现了化合物4、5、7和1、2、6及3

为主要成分的化合物的良好分离。

综合考虑固定相流失和分离效果，确定梯度条件3：0 min，100%A；50 min，100%A； 68min，80%A；88 min，80%A；150 min，45%A；230 min，0%A；280 min，0%A；280-340 min清扫模式；340-360 min顶出模式，流速为5.0 mL/min，进样量为500 mg作为LGCCC

的最佳条件。

逆流色谱的 *** ，目标化合物中1、4、6和以3为主要成分的化合物未能完全分离，

利用制备液相进一步分离，最终，实现了目标化合物的良好分离。

佛手参提取物经CCC分离得到的5段物质进行HPLC检测，4、5和7号化合物纯度 大于98%，HPLC检测结果及目标组分的紫外特征图谱。如图3-4(A-E)所示。

佛手参提取物经CCC分离出的A、E段组分用制备液相纯化，分离纯化后HPLC检测 纯度大于98%，HPLC检测结果和目标组分的紫外特征图谱。如图3-5所示。

各组分1H和13C（NM R）数据与已经报道的数据进行对比，确定从CCC中分离出来 的化合物结构为对羟基苯甲醇（1）、对羟基苯甲醛（2）、Dactylorhin B（3）、Lorogiossin （4）、Dactylorhin A（5）、对羟基苄基乙基醚（6）、Militarine（7），如图3-6所示。

结构解析数据如下：

对羟基苯甲醇(1):1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)d:7.16(2H,d,J=8.4Hz,H-2,6), 6.74(2H,d,J=8.4Hz,H-3,5),4.48(2H,s,H-7).13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)d:156.5 (C-4),132.1(C-1),128.4(C-2,6),114.7(C-3,5),63.7(C-7)。以上数据与文献[81]。

对羟基苯甲醛(2):1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)d:(1H,s,CHO),7.73(2H,d,J= 8.5Hz,H-2,6),6.85(2H,d,J=8.5Hz,H-3,5).13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)d:191.2(CHO), 166.5(C-4),132.2(C-2,6),129.4(C-1),116.3(C-3,5)。以上数据与文献[82]报道一致，确定为

对羟基苯甲醇。

Dactylorhin B(3):1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)d:7.27(4H,m,H-2',6',2'',6''),7.01 (4H,m,H-3',5',3'',5''),5.20-4.87(4H,m,H-7'a,7'b,7''a,7''b),4.86(2H,d,J=7.5Hz,4', 4''-O-Glc-1),4.58(1H,d,J=7.5Hz,2-O-Glc-1),4.47(1H,s,H-3),3.72-2.93(m,Glc-H),1.95 (1H,m,H-5a),1.83(1H,m,H-6),1.70(1H,m,H-5b),0.86(3H,d,J=6.4Hz,Me-8),0.67(3H,d, J=6.4Hz,Me-7).13C-NMR(100

MHz,DMSO-d6)d:171.3(C-1),170.4(C-4),157.9(C-4''), 157.8(C-4'),130.5(C-2'',6''),130.2(C-2',6'),129.1(C-1',1''),116.6(C-3',5'),116.5(C-3'',5''), 100.9(4',4''-O-Glc-1),97.9(2-O-Glc-1),84.6(C-2),77.5(4',4''-O-Glc-5),77.2(2-O-Glc-3), 77.1(4',4'',2-O-Glc-3),77.0(2-O-Glc-5),74.9(C-3),74.4(2-O-Glc-2),73.7(4',4''-O-Glc-2), 70.2(4',4''-O-Glc-4),69.4(2-O-Glc-4),67.9(C-7',7'),61.4(4',4'',2-O-Glc-6),44.1(C-5),23.7 (C-6),23.6(C-7),22.9(C-8)。以上数据与文献[83]报道一致，确定为Dactylorhin B。

Lorogiossin(4):1H-NMR(400MHz,CD3OD)d:7.27(2H,d,J=8.4Hz,H-2'',6''),7.16 (2H,d,J=8.4Hz,H-2',6'),7.08(4H,m,H-3',5',3'',5''),5.06(2H,d,J=11.8 Hz,H-7'a,7''a), 4.95(2H,d,J=11.8 Hz,H-7'b,7''b),4.74(2H,d,J=7.9 Hz,4',4''-O-Glc-1),4.34(1H,s,H-3), 3.87-3.31(12H,m,4',4''-O-Glc-2-6),1.88(1H,m,H-5a),1.65(2H,m,H-5b,6),0.91(3H,d,J =6.4Hz,Me-8),0.76(3H,d,J=6.3Hz,Me-7).13C-NMR(100MHz,CD3OD)d:173.3(C-1),

171.2(C-4),158.0,157.8(C-4',4''),130.2(C-2'',C-6''),129.9(C-2',C-6'),129.2(C-1',C-1''), 116.5(C-3',C-5'),116.4(C-3'',C-5''),101.0,100.9(4',4''-O-Glc-1),79.6(C-2),76.7(4', 4''-O-Glc-5),76.5(4',4''-O-Glc-3),76.0(C-3),73.5(4',4''-O-Glc-2),70.0(C-4',4''-O-Glc-4), 66.7(C-7'),66.6(C-7''),61.1(C-4',4''-O-Glc-6),43.8(C-5),23.8(C-8),23.2(C-6),22.6(C-7)。 以上数据与文献[83]报道一致，确定为Lorogiossin。Dactylorhin A（5）:1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)d:7.28(4H,m,H-2',6',2'',6''),7.02

(4H,m,H-3',5',3'',5''),5.10-4.90(4H,m,H-7'a,7'b,7''a,7''b),4.86(2H,d,J=7.5Hz,4', 4''-O-Glc-1),4.66(1H,d,J=7.8Hz,2-O-Glc-1),3.68(2H,m,4',4''-O-Glc-6a),3.57-2.86(m, H-3a,H-3b,Glc-H),1.81-1.58(3H,m,H-5a,H-5b,H-6),0.83(3H,d,J=6.1Hz,Me-8),0.77 (3H,d,J=6.1Hz,Me-7)。13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)d:172.6(C-1),170.4(C-4),157.8 (C-4',4''),130.4,130.2(C-2',6',2'',6''),129.4,129.2(C-1',1''),116.6(C-3',5',3'',5''),100.8(4',

4''-O-Glc-1),98.8(2-O-Glc-1),80.0(C-2),77.5(4',4''-O-Glc-5),77.4(2-O-Glc-5),77.1(4',4'', 2-O-Glc-3),74.3(2-O-Glc-2),73.7(4',4''-O-Glc-2),70.2(4',4''-O-Glc-4),70.0(2-O-Glc-4), 66.7(C-7’),66.1(C-7''),61.2(4',4'',2-O-Glc-6),46.6(C-5),42.0(C-3),24.6(C-8),24.2(C-7), 23.6(C-6)。以上数据与文献[83]报道一致，确定为Dactylorhin A。

对羟基苄基乙基醚（6）:1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)d:7.15(2H,d,J=8.4Hz,H-2, 6),6.75(2H,d,J=8.4Hz,H-3,5),4.38(2H,s,H-7),3.51(2H,q,J=7.0 Hz,H-8),1.19(3H,t,J =7.0 Hz,H-9).13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)d:156.9(C-4),129.3(C-2,6),129.0(C-1), 114.7(C-3,5),72.2(C-7),63.9(C-8),14.0(C-9)。以上数据与文献[84-85]报道一致，确定为对

羟基苄基乙基醚。

Militarine（7）:1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)d:7.27(4H,m,H-2',6',2'',6''),7.01(4H, m,H-3',5',3'',5''),5.10-4.91(4H,m,H-7'a,7'b,7''a,7''b),4.86(2H,d,J=7.1Hz,4',4''-O-Glc-1), 3.68(2H,m,4',4''-O-Glc-6a),3.54-3.11(10H,m,4',4''-O-Glc-2,3,4,5,6b),2.86(1H,d,J= 15.3Hz,H-3a),2.58(1H,d,J=15.3

Hz,H-3b),1.66(2H,m,H-5a,6),1.53(1H,m,H-5b),0.85 (3H,d,J=6.6Hz,Me-8),0.74(3H,d,J=6.6Hz,Me-7).13C-NMR(101 MHz,DMSO-d6)d: 174.6(C-1),170.0(C-4),157.8(C-4''),157.7(C-4'),130.1(C-2',6',2'',6''),129.7(C-1''),129.5 (C-1'),116.6(C-3',5',3'',5''),100.8(4',4''-O-Glc-1),77.5(4',4''-O-Glc-5),77.1(4',4''-O-Glc-3), 75.4(C-2),73.7(4',4''-O-Glc-2),70.2(4',4''-O-Glc-4),66.4(C-7'),65.9(C-7''),61.2(4', 4''-O-Glc-6),48.0(C-5),45.2(C-3),24.8(C-8),23.8(C-6,7)。以上数据与文献[83]报道一致，确 定为Militarine。

佛手参提取物中化合物极性广泛，本实验建立了适合于佛手参提取物的线性梯度洗脱

-清扫-顶出的逆流模式，构建了合适的乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，并在分离过程中优化 了梯度条件和进样量。以乙酸乙酯-水溶剂体系的下相为固定相，上相为流动相A，正丁醇 -水溶剂体系上相为流动相B。LGCCC的最佳条件：0 min，100%A；50 min，100%A；68 min，

80%A；88 min，80%A；150 min，45%A；230 min，0%A；280 min，0%A；280-340 min清 扫模式；340-360 min顶出模式，流速为5.0 mL/min，进样量为500mg。逆流色谱实现了化 合物4、5和7的良好分离。同时被分离的化合物1、2、6和3通过制备液相进一步分离 纯化。最终实现佛手参提取物中的7种高纯度化学成分高效、快速、准确的分离制备。

天然产物成分复杂多样，比如相似的结构和广泛极性的成分。在只有一种操作模式的

单维HSCCC中很难分离所有目标化合物，HSCCC与不同洗脱方式的结合，为从复杂样品

中分离和鉴定化合物提供了新的策略，是从复杂天然产物提取物中分离化合物的有效技

术。使用CCC模式的组合，可以高效、准确的从复杂的粗样品中分离出大量的组分。

样品在溶剂系统中分配系数最佳范围是0.5-2，且各组分的分配系数之间有一定差异的

溶剂系统选择原则，选取相应溶剂体系，综合考虑温度、流速、转速对固定相保留率和分 离效果的影响，选择最佳的逆流色谱分离参数，不同分离方式相结合，实现了对其化学成 分高效、快速、准确的分离制备。

番荔枝叶和佛手参作为传统的药食同源植物，富含多种活性成分，应用历史悠久。最

近研究发现，均对抗氧化、降血糖的治疗和预防效果显著,进一步引起了国内外专家的广

泛关注，拟对番荔枝叶、佛手参粗提物及分离获得的化合物拟进行后续药理研究，对其抗 氧化和降血糖活性进行评价，为筛选特定活性物质提供依据。

糖尿病严重威胁人类的生活品质，双胍类等临床缓解、治疗糖尿病的药物，在发挥治 疗作用的同时，也常伴副作用产生。开发新型、高效低毒的降糖药物亟待解决。

胰岛素抵抗是II型糖尿病的主要发病机制。胰岛素抵抗是多种病因和发病机制共同作

用、相互影响所引起的一种以胰岛素生物效应下降为特点的病理状态。炎症反应、氧化应

激引起胰岛素抵抗已经得到了人们的共识。研究胰岛素抵抗的发生原因及特点,有助于对II 型糖尿病更好地预防与治疗[86]。

番荔枝叶具有良好的药理活性，抗氧化和抗炎效果显著，在预防医治糖尿病上有很好

的成效。本实验探究了番荔枝叶粗提物及5种黄酮类单体化合物的抗氧化和抗糖尿病活性

体外评价，为定向分离其中较好的活性成分提供了依据，对更深入的研究黄酮类降血糖机 理有重要意义。

DPPH-HPLC-DAD法对粗提物进行抗氧化活性的筛选，将番荔枝叶的粗提液与10 mmoL DPPH（纯度大于98%）混合，置于37℃温度条件下的孵育箱反应30 min。反应后 的溶液通过0.45 um滤膜过滤，置于液相取样瓶并标号，进行HPLC分析。未经反应的粗

提物作为对照。

HPLC分析条件如下：色谱柱为SYMMETRY-C18(250 mm×4.6 mm，5.0μm)；流动相 为乙腈/0.1%乙酸水溶液（16:84，v/v)，流速为1.0 mL/min，进样量10 uL，检测器波长254 nm。

抗氧化能力通过DPPH测定法进行实验，按照文献[88]中记录的 *** 并进行适当修改。 将DPPH（2.5 mg）溶于100 mL乙醇，以25 ug/mL的浓度制备标准溶液。使用连续稀释 法以0、5、10、15、20和25 ug/mL的浓度在乙醇中制成标准溶液。紫外分光光度法517 nm 下对6种溶液的吸光度值测定，并绘制其标准曲线。

将DPPH（2.0 mg）溶于100 mL乙醇中制成浓度为20 ug/mL的标准溶液，制备含不 同浓度维生素C（阳性对照）、粗提物和单体化合物的溶液作为实验样品。将3 mL标准 溶液与样品组的2 mL溶液一起加到10 mL比色皿。对照组用3 mL乙醇加到10 mL比色 皿中，加入2 mL样品溶液，空白对照组用3 mL标准溶液加2 mL乙醇。用紫外分光光度 法测定各混合物在37℃下孵育30 min时在517 nm处的吸光度，每种浓度测定三次，计算 平均值。以DPPH自由基清除率评价其抗氧化活性。

DPPH清除率按以下公式计算：

清除率（%）=[A517nm空白溶液–（A517nm样品溶液–A517nm对照溶液）]/A517nm空白溶液 ×100%

取出冷冻的细胞并迅速放入37℃水浴锅中，使细胞缓慢解冻，将细胞吸取至无菌细胞 培养瓶中。人体肝癌细胞（Human hepatoma cell line，HepG2）细胞加入青霉素（100 U/mL） /链霉素（100 ug/mL）和10%胎牛血清的DMEM中培养。将细胞置于37℃、5%CO2的细 胞培养箱中孵育。用胰蛋白酶溶液消化在对数生长期的HepG2细胞，选用对数生长期的细 胞实验。通过细胞计数，将细胞密度用培养基调至5×104/mL。

番荔枝叶提取物和HSCCC制备的单体化合物，细胞毒性活性通过MTT测定法在 HepG2（人肝癌细胞系）细胞中测定。按照文献[87]中的 *** 进行实验，并进行适当修改。

将细胞密度5×104/mL的细胞，用高压灭菌后的移液枪吸取100 uL/孔的体积进行接 种，在37℃、5%CO2条件下，将浓度分别为15、30、60、120、240 ug/mL的番荔枝叶粗提物和单体化合物样品接种到96孔细胞培养板中，作为样品组，此外，设置不加样品的 对照组。在37℃、5%CO2的培养箱中孵育接种后细胞24小时。酶标仪吸光度设置为波长 570 nm的条件，测定96宫板的吸光值，通过吸光值的数值测定细胞活力。

各样品对细胞活力的影响按以下公式计算：

细胞存活率（%）＝处理样品的A570nm/未处理样品的A570 nm×100%。